示意图简洁明了的阐述了免疫微环境中的几个关键要素以及相对应的作用机制：anti-CTLA-4和anti-PD-1/L1的作用机理；以anti-CD40为代表的共刺激检查点激动剂的作用机制；TGF-β和PD-1双抑制剂M7824作为“升级版anti-PD-1”的作用机制；以及微生物作为免疫微环境调节的关键因素等。

类似的示意图成百上千，仅作为示意功效来看，这是极好的，还有些卡哇伊，但看的时间久了，不免会产生一些误解，譬如：

1、抗体就是整个呈“Y”字形的；

2、抗体和受体的结合方式就是卡槽式的无缝对接；

3、抗体虽然很小，不像图示比例那么夸张，但既然是大分子，因此在细胞表面，要比TKI要显著的多……

诸如此类的疑问和误解还有很多，其实示意图只是传达个大概意思，对于抗体的理解，需要更加的深入和精确。如同著名的美国结构晶体学家、1995年拉斯克基础学奖得主Don C. Wiley（1944-2001）所言：

“ I'm sorry, but I just don't understand anything in biology unless I know what it looks like.”

Don C. Wiley（1944-2001）

如果你对于曾经肆虐全球的A型流感病毒有所了解的话，对于相应的抗病毒药物扎纳米韦和奥斯他韦就一定不陌生，这两种药物的诞生，正是基于Wiley教授对于A型流感病毒晶体结构的深入研究而开发的。Wiley是个彻彻底底的唯物论者，可谓结构理论界的钢铁直男。

既然如此，我们来一起看看吧，那些在过去几年里让肿瘤治疗波澜万丈的明星大分子---Checkpoint inhibitor 在微观结构中都是些什么样子。

在进入微观世界之前，我们先来了解一些基本的概念，先来介绍一个单位：埃（Å），似曾相识的感觉，有木有？换算关系如下：10埃= 1纳米，1000纳米=1微米，1000微米=1毫米，在原子的世界中，埃就是衡量彼此间最适合的单位，打个比方，如果你和你的同事都是氢原子，那么你们所处的格子间差不多就是在10 Å以内的水平。一个抗体有多大呢？以IgG为例，差不多是10-15nm，那么B细胞有多大呢，直径大约7μm。如果把B细胞的球面展开（把凹凸面也算在内），铺平后的面积大概是多少呢？

做个简单的换算后，你就可以发现：如果把抗体比作一个身高1.8m的成年人，那么B细胞表面积就有三个纽约中央公园那么大（就是下面这张卫星图的大小，中间的绿色部分是中央公园），如果你不太了解中央公园的大小，那换成我们熟悉的地方，大概就是三个圆明园的面积。据小V溜娃的经验，把圆明园从南到北，从东到西的大致逛一遍（加上坐船）大概需要一个下午的时间，可见，抗体在B细胞表面是多么的渺小。

接下来，为了方便理解，我们再来复习一下蛋白质的四级结构：

图片引自公众号“小张聊科研”

蛋白质的结构从低维度到高维度划分为四级：

一级结构——氨基酸序列；

二级结构——主链原子形成的局部空间构象，如α螺旋，β折叠；

三级结构——二级结构在三维空间排列形成三维结构；

四级结构——不同亚基组成的蛋白质复合物大分子。

在二级结构和三节结构之间，还存在超二级结构（有些书籍称作motif，模体/基序）以及结构域（domain）。

简单来说，如果把一级结构比作骨架，那么龙须、龙爪、龙角就是各个二级结构，或螺旋，或折叠，每个龙珠所在的盘曲就是一个三级结构，整个蛋白质就是盘亘的神龙。

下面我们就来一步步解开神龙的秘密。

一星龙珠：Y字的奥秘

IgG抗体为什么用Y字示意？是因为免疫球蛋白本质上作为一种蛋白质，其结构分为轻链（VL）和重链（ VH），整体呈现的形状类似于Y字，其中位于Y字顶端的部分（Fab段）称为可变区，功能是识别或结合抗原，其中识别抗原的部分又成为高变区；其余的部分称为固定区或恒定区，特别是Y字结构的底部，称为Fc段，可激活补体，介导CDC效应；也可结合Fc受体，发挥促吞噬作用，介导ADCC及1型超敏反应。

我们将高变区的结构进行放大（如图），就是多个三级结构的呈现。至于高变区是怎样和PD-1/PD-L1结合的，就涉及到了PD-1/PD-L1的结构。

二星龙珠：PD-1与PD-L1/PD-L2的结合

现在我们知道，PD-1不仅可以和PD-L1结合，还可以和PD-L2结合，所用的示意图呢，如同插头和插座一样，而在微观世界的分子层面上并非这么简单。

早在1997年，人类的CTLA-4的晶体结构首先用核磁共振的方法探明并发表在《NATURE》上。这是最早发现的和PD-1结构相似的受体，论文中的图示如下：

虽然这图是丑爆了，但揭示了CTLA-4的一个重要特征，之后发现的PD-L1结构中也有类似结构：这就是上图b中用红蓝两色表示的共7条β折叠结构，形成了双层的结构域，而这个双层结构（double β-sheet）就是CTLA-4结合配体的核心区域。

类似于EGFR-TKI和ATP结合口袋的结合，就算是大分子，在相互接触的接触面上也是靠着具体位点的相互作用产生亲和力的，其中结合的位点，称为“热点”（hot-pots）。结构的不同导致了接触面热点的变化，进而决定了不同药物和相应位点的结合力的大小（如下图）。再回到PD-1和PD-L1/L2的结合，具体的作用位点如图所示：

可见，尽管PD-L1和PD-L2结构非常相似，但细微的变化使得两者和PD-1同一接触面所发生作用的位点也不一致。PD-L1的结合位点为121-125，而PD-L2则是从110到114。

三星龙珠：抗PD-1药物与PD-1的作用

目前最为知名的两种抗PD-1药物就是BMS公司的nivolumab和MSD公司的pembrolizumab，两家的恩怨纠葛由来已久，再此对于临床研究数据不再详述，我们从结构生物学的角度来分析一下。

如图所示，可见同样是和PD-1（灰色）结合，两种单抗的结合部位是不尽相同的。两类药物部分覆盖了PD-L1（蓝色）和PD-1的结合位点，而又各自有自己独特的结合部位：pembro（粉红）会和C’D-loop结合，而nivo（绿色）主要和N-loop（红色）结合。

换个角度，从PD-1的结合面上看是这样的：

左图中蓝色是PD-1和PD-L1结合的区域，中间是pembrolizumab和PD-1结合区域，紫色和黄色分别代表重链和轻链结合部位，右侧是nivolumab的结合区域，橙色和红色分别代表重链和轻链结合的部位。直观的印象是什么？似乎nivolumab和PD-1结合的部位主要在下侧和背侧，pembrolizumab和PD-L1重叠的区域更多。这是否在一定程度上影响到两类药物疗效的差别呢？不得而知。

四星龙珠：抗PD-L1药物与PD-L1的作用

相比于PD-1,抗PD-L1的药物目前更多，包括Atezolizumab（Roche），durvalumab（AZ），avelumab（Pfizer），除此以外，还有众多在研的药物，如：BMS-936559，KN035等。

需要注意的一点是，当pembro和nivo与PD-1形成复合物时，PD-1的构象发生了较大改变，导致了两类药物结合区域的差别较大；和PD-1与抗PD-1类药物不同，研究显示，当上述药物和PD-L1结合形成复合体时，‍ PD-L1结合面的构象改变并不明显，结合区域结构相对保守，每个anti-PD-L1药物都可以覆盖原本PD-1和PD-L1结合的部位，如图所示：

相比较而言，Atezolizumab与PD-L1结合的面积最大，将近2000Å2，其他三种药物结合面积相似，只是角度不同。

五星龙珠：抗CTLA-4药物与CTLA-4的作用

上文提到了CTLA-4的晶体结构是最早发现的，结合之前早就了解的CTLA-4与B7对应结合的机制，在晶体结构水平，它们的对应关系是这样的：

紫色代表CTLA-4的胞外区，CTLA-4形成二聚体后和B7H1(绿色)结合，产生抑制作用。以tremelimumab（AZ）为例，它和CTLA-4结合的模式是这样的：

可见，tremelimumab不仅占据了结合位点，还像千斤顶一样，撑开了T细胞和肿瘤细胞间的距离，导致即便没有药物的情况下，CTLA-4和B7H1也不易结合，目前这种理论还是一种假说，有待进一步认证。

Tremelimumab和CTLA-4的结合（右侧）也类似于之前的情况，部分覆盖了B7H1的结合区域（左侧），中间的红色为重叠部分。

六星龙珠：热点

刚才提到了，抗体结合面上发生左右的关键位点，我们称其为“热点”，发生作用的方式主要是氢键。以durvalumab为例，研究显示，其与PD-L1结合的主要热点为：D26、Y123、K124、R125等等:

如图所示，这些位点多位于重链结合部位，其他药物（atezolizumab/avelumab/BMS）结构也有此特点，因此目前认为，相比于轻链，重链是决定药物结合效率的关键部位。

因为PD-1和PD-L1是相对的接触面，所以抗PD-1药物的热点有所不同，又因为之前提到的PD-1的构象变化较大，所以热点并不一致，以pembrolizumab为例，热点如下：

待发现的七星珠：小分子checkpoint inhibitor

到目前为止，从结构生物学的角度上，关于checkpoint 作用机制的探索已经逐步深入，既有大分子抗体尽管在过去几年取得了一定疗效，但仍存在诸多不足之处：

1、分子量大，一般都在150KDa左右，在复杂的肿瘤微环境中，发生未知作用的可能性大；

2、作为免疫球蛋白，其Fc段所诱发的CDC和ADCC效应始终不能被很好的理解和控制；

3、T细胞,DC细胞都会表达PD-1/PD-L1，不可避免的会发生交叉作用。以上几点都会影响药物的疗效，增加不良反应的风险。

人们结合“热点”的概念，基于已有的小分子研发经验，自然会想：同样是阻断，为何不能设计出一类小分子结构药物？既然PD-1/L1的结合机制相对明确，只要阻断两者的结合位点，理论上应该可以达到和大分子抗体相近的效果，就如同靶向治疗中EGFR-TKI中专门针对T790M和C797S的设计思路。目前相关的化合物已经在设计摸索之中，报道较多的是BMS202和BMS-8，以202为例，结合机制如下图。

可见，小分子阻断剂的设计理念更为直接，如同在插头和插座之间放了一片隔膜，达到阻断效果。目前，该类研究还处在基础研究阶段，是一颗尚未发现的龙珠。

部分参考文献：

1、Matching cellular dimensions with molecular sizes. NATURE  IMMUNOLOGY VOLUME 14 NUMBER 8 AUGUST 2013

2、Understanding the structural and energetic basis of PD-1 and monoclonal  antibodies bound to PD-L1: A molecular modeling perspective. BBA - General Subjects 1862 (2018) 576–588

3、Structural Biology of the Immune Checkpoint Receptor  PD-1 and Its Ligands PD-L1/PD-L2. http://dx.doi.org/10.1016/j.str.2017.06.011.

4、Solution structure of human CTLA-4 and delineation of a CD80/CD86 binding site conserved in CD 28.Nature structure biology. Volume 4. number 7, July 1997

5、Structural basis for small molecule targeting of the programmed death ligand 1 (PD-L1).Oncotarget, 2016,Vol. 7, No. 21 

6、Small-Molecule Inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) Interaction via Transiently Induced Protein States and Dimerization of PD-L1.J. Med. Chem. 2017, 60, 5857−5867

7、Structural basis of the therapeutic anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 52), pp: 90215-90224