血小板检测方法可归纳为出血、血栓和药物监测3大类。虽则有些方法能应用于多种检测目的，但为特殊目的而创建的方法亦有重要价值。故在检测时应合理地运用。
1 出血性疾病监测中的应用
血小板的基本功能是黏附、聚集、分泌、促凝血、血块回缩。通过这些功能维持着正常人体的初期止血作用。由于这些功能异常而导致的出血疾病包括遗传性和获得性两类，在有些疾病同时会有血小板功能异常和数量减少。
1.1 遗传性血小板功能异常疾病
① 黏附受体蛋白异常：GPIb?Ⅴ?Ⅸ(BSS,血小板型vWD,Bolin?Jamieson 综合征)、GPⅡb/Ⅲa(血小板无力症)、GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ。
② 可溶性激动剂受体异常:TXA2受体,P2Y12受体、α2?肾上腺素能受体。
③ 血小板颗粒异常:δ?颗粒(δ?贮存池缺陷、Hermansky?Pudlak综合征等)、α?颗粒 (灰色血小板综合征，Quebec血小板病等)。
④ 信号传递途径异常:TXA2途径异常、Ca离子流动异常、Gαq缺陷、GSα高反应、PLC?pleckstrin磷酰化缺陷。
⑤ 膜磷脂异常:Scott综合征、Stormorken综合征。
⑥ 其他异常:原发性释放异常、Montreal综合征、Ehlers?Danlos综合征、 May?Hegglin综合征等
1.2 遗传性血小板数量减少疾病
① 体积减小：Wiskott?Aldrich综合征、性联血小板减少症。
② 体积正常：家族性血小板病、先天性无巨核细胞性血小板减少症。
③ 体积增大：巨大血小板综合征、血小板型vWD、May?Haegglin异常、灰色血小板综合征、Montreal血小板综合征。
1.3 获得性血小板功能异常 这种异常十分常见，可由下列不同原因引起：① 药物、食物和维生素;② 慢性肾衰;③ 体外循环;④ 骨髓增生异常疾病;⑤ 抗血小板抗体等。
血小板功能缺陷检测的方法包括：① 血细胞分析仪在测定血小板数量及外形大小中应用;② 血小板功能:出血时间(血小板功能分析仪，(FPA?100R)、 黏附性测定、 聚集功能测定、 释放功能测定(致密颗粒：5?HT、ADP、ATP、δ?颗粒缺陷?Hermansky?Pudlak 综合征、Chediak?Hygashi 综合征(荧光法)、α?颗粒：TF4、β?TG(α?颗粒缺陷?灰色血小板综合征、Quebec 血小板病、Jacobsen或Paris?Trousseau 综合征)(ELISA法，试剂盒),PF3有效性; Ca2+释放与内流,、血栓烷形成、cAMP、GAMP;血块回缩;③ 膜受体分析采用流式细胞术和电泳术(黏附受体GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb，激动剂受体P2Y12、GPⅥ);④ 基因分析采用分子生物技术;⑤ 其他(超微结构)。
上述检测方法目前巳成为疾病诊断的基本手段，但随着对疾病的病理机制的深入研究以及包括血小板信息传递在疾病中的新的认识，许多蛋白分析技术巳逐渐成为研究方法中的一部分，但它们的应用可能仅限于研究目的而言，而不适合一般医院的临床检测应用。
血小板体积测定不仅能反映血小板生成及衰老，而且在鉴别遗传性血小板疾病中也是一项十分有用的指标。在巨大血小板综合征中的巨大血小板在末梢血涂片可达80%，其直径达到20 μm以上。最新也有报道非巨大血小板综合征而血小板体积明显增大数量减少病因不清的遗传性巨大血小板减少症。体内出血时间结合血小板数曾是血小板数量与质量异常所致出血的筛选试验，但由于出血时间存在种种不足而被弃之不用。血小板黏附性所测得的结果是血小板聚集和黏附的总和，不能独立反映黏附功能也被弁之。
PFA?100TM是一种模拟体内初期止血的测定仪，又名“外出血时间”，结果以血小板闭塞网眼停止血液流动的“闭合时间”表示。故可以检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的疾病，血栓性疾病、GPⅡb/Ⅲa拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、血管性血友病及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。与出血时间试验相比，在诊断vWD中的敏感性>90%。由于此项检测所需费用较高，限制了其广泛应用。
血小板聚集性测定是被应用最广泛、发展和改进最多的一项测定。至今为止，巳发展而成的血小板聚集仪包括有比浊法、阻抗法(全血血小板聚集仪)、光散射法和Verify Now分析仪(Ultegra快速血小板功能分析仪)。在测定血小板聚集的仪器中，设计有可以同步测定血小板腺核苷酸释放和血小板胞浆Ca2+浓度的装置，具有多功能性。
比浊法最常用，诱导剂通常为ADP、胶原、花生四烯酸和瑞斯托酶素等4种。但存在标本分离、制备、诱导剂种类与浓度选择、正常值设定等影响因素，缺乏各实验室之间的可比性。在一项误差分析中，其总体的SD为3.7%～7.7%。所以，对一份聚集率为64.81%±7.7%,其分布范围49%～80%，从个体化角度进行判断分析时，其意义较为有限。在遗传性血小板功能性疾病中,由于聚集反应显著下降，这类误差不影响临床诊断，是一项十分有用的指标。
其他各项试验譬如颗粒释放产物、花生四稀酸代谢产物，血小板膜磷酯酰丝氨酸、Ca2+、膜糖蛋白、基因分析等项目在诊断疾病中仍被继续广泛应用，是诊断血小板功能疾病所必需的基本检测项目。但由于遗传性血小板疾病在临床上颇为少见，一般医院很难具有独立地全面检测这类疾病的能力，许多试验仍未能广泛应用展开。
2 血栓性疾病监测中的应用
在血栓性疾病中存在着血小板的短暂或持续活化。活化的血小板其形态、功能或蛋白的结构变化，这些变化构成了活化标志物检测的基础。目前用于血栓性疾病检测的方法有:
2.1 血小板聚集 是至今为止在检测血栓性疾病中仍能应用的一项试验，但其灵敏度不高。譬如比浊法，它既不能检出低于5个血小板组成的聚集反应，也不能检测循环血小板聚集体。鉴于这些需求，随后出现了一些新的方法，譬如Wu & Hoak报道的全血血小板聚集体检测法,血小板对ADP/AA聚集反应阈值和自发性血小板聚集体测定法, 检测血小板聚集反应中所形成大小不同的聚集体激光衍射法，或采用血小板计数仪测定聚集后的标本中剩余的血小板数等。PA?200型聚集仪(Kowa,Japan)是通过光散射及一系列复杂镜片组建成的激光衍射仪，能检出PRP中由2至3个血小板组成的聚集体。用此项检查，发现在急性冠状动脉综合症中存在<100个血小板组成的聚集体，现已应用于急性冠状动脉综合征、脑卒中和TTP等血小板高反应性疾病中。但在遗传性的黏性血小板综合征中，患者血小板对ADP和/或肾上腺素诱导的血小板聚集反应增高，采用比浊法血小板聚集仪即可予以诊断。
血小板聚集虽然存在不灵敏的反映血栓形成，但最近人们发现，通过计算方法的改进成为可预示经皮冠脉介入治疗后患者心肌损伤的标志物。2007年Marcucci等在367例PCI后发生急性心梗患者的心肌损伤测定中进行了此项研究。此项方法命名为残留血小板反应性(residual platelet reactivity,RPR)检测法。它以血小板聚集率和PFA?100中测得的闭合时间为基础，以超出对照组血小板聚集率第90%者值或低于PFA?100中闭合时间203 s(CT/EPI )作为临界值，计算 RPR。采用此法检测时所测得的RPR值与反映心肌梗死的指标CK?MB和cTnl基本一致(P<0.0001)，是当前以血小板功能检测来反映心肌梗死的较好的方法。
2.2 网织血小板测定 此系2008年Cesari 等描述的一项能反映ACS的有用指标。其原理是血小板中残存的mRNA用噻唑橙黄荧光染料标记，在Sysmex XE?2100 血液分析仪中测定。观察网织血小板百分率%(IPF)和反映mRNA总量的荧光强度%(H?IPF )。在ACS组中IPF和H?IPF明显升高，表明ACS中血小板周转加快。
2.3 活化标志物 分可溶性与非可溶性两类。
2.3.1 可溶性血小板活化标记物 β?TG、 PF4、TXB2、 5?HT，P?选择素、Ca2+。
血小板颗粒内容物的释放产物PF4和β?TG曾作为血小板储藏池疾病和血小板活化标志物，但由于在操作过程中常可引起血小板体外活化，故二项 指标已逐渐为其他指标所替代。
过去几年采用过的前列腺素代谢产物TXB2,在作为反映血小板活化方面也因存在体外活化的问题，而11?去氢? TXB2是相对稳定的终末产物，其结果更可靠。P?选择素存在于血小板和内皮细胞。血小板表面的P ?选择素是活化过程中α颗粒膜上的P ?选择素与血小板表面膜整合产物，在静息血小板表面上很少，是血小板活化的较特异的标志物。但活化血小板表面的P ?选择素与血液中白细胞相互作用后很快丢失，因此，这项指标在反映活化程度中的灵敏度也有所降低。可溶性P ?选择素虽则在几年前也被视为血小板活化标志物，但1997年Fijnheer通过在ITP、TTP等的观察中，证明可溶性 P?选择在正常人中的主要来源是血小板，但在许多疾病状态时是来源于内皮细胞，其特异性不如血小板P ?选择素。在作为血小板活化标志物的选择上应选用血小板表面P ?选择素。
作为细胞信使的某些成份如cAMP、Ca2+等在血小板基础研究中予以应用，其中血小板胞浆Ca2+浓度的测定随着它与某些临床疾病之间关联的发现，现已在血脂增高和降血脂治疗，以及动脉粥样硬化患者中检测应用。常用方法是采用Fura?2的荧光法，也可采用带有钙离子浓度测定的血小板聚集仪。
2.3.2 非可溶性血小板活化标记物 CD 62p、CD 63、LAMP?1、CD40L、GPⅡb/Ⅲa、磷脂酰丝氨酸,微粒,白细胞?单核细胞聚集体,微小血小板聚集体。
血小板膜糖蛋白Ⅰb、Ⅱb/Ⅲa、Ⅴ、Ⅰa等是参与血小板黏附和聚集功能的主要黏附蛋白，在一些遗传性血小板疾病中明显下降，而在血栓性疾病中也可见到某些糖蛋白表达增高。采用相应的单抗可检测这些膜糖蛋白在膜表面表达量及血小板活化时的分子构型改变，作为血小板活化标志物。
CD 40L位于α颗粒，血小板活化时表达在血小板表面，参与血小板间，或与白细胞间黏附和聚集，与P?选择素相似，是活化的重要标志物。表达在血小板表面的CD 40L断裂后流入在血液中，则为可溶性CD 40L(sCD 40L)。在血小板表面及血液中的CD 40L是目前临床应用的两个活化标志物。
新近报道的血小板活化标志物包括血小板促凝活性、微粒和单核细胞?血小板聚集体检测等3项指标，在一些文献中已有应用报道，其敏感性可能优于现用的金标准P?选择素。血小板促凝活性采用能与磷酯酰丝氨酸结合的Annexin V作标志物，通过流式细胞仪测定与Annexin V 联结的FITC荧光强度，可获得血小板表面参与凝血反应的磷酯酰丝氨酸的量。
血小板微粒是血小板活化时从血小板囊孢脱落或伪足断裂而存在血液中的颗粒,直径为0.1～1 μg。血小板颗粒表面含有血小板特有的蛋白，譬如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、P?选择素和PAF等。在流式细胞仪中根据上述显示血小板特征的标志物再结合颗粒大小可以与血小板及来源淋巴细胞、内皮细胞区别开，予以定量。微粒生成的机制可能与血小板黏附聚集、免疫复合物及依赖与不依赖补体的抗体作用有关。在临床上巳报道了在某些疾病中微粒数量减少，譬如Scott综合征、逆Scott综合征等，而有些疾病中微粒数量增高，譬如ITP、TIA、急性冠脉综合征、糖尿病、抗磷脂抗体综合征等。单核细胞?血小板聚集体在急性冠脉综合征、心肌梗死中增高，在这类血栓性疾病中血小板GPV也明显升高。基因分析主要限于膜表面的几种糖蛋白( b、b/a、V、PLA1、PLA2等)。现巳报道血小板GPⅢa,GPⅠb和GPⅠa基因多态性与血栓性疾病相关。
不同方法在血栓性疾病检测中的灵敏度为：P?选择素、DH?TXB2、促凝活性(PPA)、微颗粒 (PMP)、膜糖蛋白、白细胞?血小板聚集体、微小聚集体> TXB2、 TSP、β?TG>血小板聚集。
血小板检测在血栓性疾病中具有多方面的应用价值，包括血栓前状态的检测; 指导抗血小板药物治疗及疗效判断; 血栓性疾病的鉴别诊断; 预后。譬如缺血性脑卒中其CD 62,CD 63升高在脑血管自身病变引起的患者较心源性中为高;在急性心肌梗死与心绞痛比较时，前者血小板?单核细胞聚集体高于后者。在用阻抗法检测孕妇是否发生先兆子痫时，在妊娠25周前用ADP,胶原或花生四烯酸诱导血小板聚集增高时，其阳性预示率几乎100%。
3 药物监测中的应用
实验室监测抗血小板药物的目的在于药物的安全性和有效性。安全性主要是指出血副作用，但在常规的剂量下，药物的出血副作用是很轻微，通常不需监控。随着ASA和氯吡格雷“抵抗性”的报道，引起了人们的重视。在过去的20多年中，人们对不同方法在“抵抗性”方面检测意义作了评估。由于每一种药物都有它们特定的作用点?靶向，检测需要能反映靶向的状态。 “抵抗性”的检测从原理、方法上与出血疾病和血栓性疾病间存在着很大区别。
3.1 ASA抵抗性及其监测： ASA是应用最广泛的血小板聚集的抑制剂，它通过乙酰化环氧化酶?1(COX?1)中529位丝氨酸的羟基而不可逆地灭活该酶活性，而阻碍花生四烯酸与385位酪氨酸的活性位点结合，阻止血栓烷A2(TXA2)的形成。
ASA抵抗性的定义包括实验室定义和临床定义，前者以实验室检测指标判断，ADP诱导的血小板聚集率高于特定水平，显示抑制作用很低;后者以临床缺血事件发生率来评定。ASA抵抗性早在1993年Grotemeyer等发现在脑卒中患者有报道，2005年Campbtell等汇总文献资料，根据血小板功能(出血时间、血小板聚集比值、比浊法、全血法血小板聚集、11去氢TXB2以及PFA?100TM等)检测的结果，显示采用不同检测方法和判断标准所报道的ASA抵抗性发生率范围相当大(8%～64%)，而采用特异的靶向反应及其产物相关的试验血清TXB2和花生四烯酸诱导的血小板聚集试验，ASA抵抗性的发生率并不高，仅为1%～1.7%和<1%。由于ASA抵抗性者的血栓形成发生率增高，因此，尽管存在着定义、检测方法、发生率以及机制等方面的认识差异和争议，但对抵抗性检测是否纳入临床常规检测尚无一致意见。
Michelson等2006年在欧洲心脏病杂志提出监控ASA抵抗性推荐的检测指标，而以血清TXB2为优选项目：
① 血栓烷作为终点:血清TXB2, 尿11?去氢TXB2。② 花生四烯酸作为刺激剂: 比浊法血小板聚集仪, 阻抗法血小板聚集仪、Verify Now 阿司匹林分析法、Plateletworks、 血小板表面活化的GPⅡb/Ⅲa、血小板表面P?选择素、 白细胞–血小板聚集体 (流式细胞仪)、 TEG 血小板绘图仪、 锥板式血小板分析仪、T?导向装置型血栓显示器。③ 其他。PFA?100TM，PlaCor PRT 尿11?去氢TXB2在病理状态下约1/3来源于非血小板成份，所以特异性不强。血清TXB2的灵敏度高，特异性强，能较好地反映ASA作用靶向的环氧化酶?1的抑制状态，但其存在检测方法上快速提供结果的限制。而在我国的医院中,比浊法血小板聚集仪广用比较广泛，虽然其操作技术要求比较高，存在许多不足，但能当天提供结果，及时指导对患者的用药，同时采用花生四烯酸诱导的血小板聚集反应，能反映出COX?1的抑制程度，因此适合目前条件下大多数实验室的监控要求。2008年Guthikonda等采用亚最大浓度的花生四烯酸作为聚集诱导剂时，发现ASA抵抗者的聚集反应较无抵抗者高。提示了这类患者有可能在用药前检出。如果此项结果得以进一步证实，在临床上有较大意义。
3.2 氯吡格雷抵抗性及其监测： 人血小板ADP受体属于P2型，有P2Y12、P2Y1两种，噻氯匹定和氯吡格雷为ADP的P2Y12受体拮抗剂。
2003年德国Müller等在105例稳定性冠状动脉疾病作PCI时使用氯吡格雷中约有5%患者对药物呈无反应，这些人术后发生血栓形成增高。随后氯吡格雷“抵抗性”得到进一步证明。在Matetzky等报道中指出，非ST段升高心梗作PCI患者用ADP聚集试验检测时抵抗性发生率为25%。 Gurbel等用P?选择素和GPⅡb/Ⅲa检测时，抵抗性发生率在5 d为31%，在30 d为15%。目前认为，氯吡格雷“抵抗性”依据使用的定义和检测方法不同约为5%～43%。据Matetzky等报道,有抵抗性的患者.在半年随访中者发生不良事件占40%。有抵抗性者的临床预后欠佳。
许多检测方法巳作过评估，适用者有：
(1)全血血小板聚集(血小板计数法)：在全血中加入诱导剂，计数全血中单个血小板数的减少视作为血小板聚集体形成。方法简易，较比浊法敏感，它能检测到非常小的聚集体。尚缺乏大量应用的经验。
(2)血栓弹力图：检测全血中血块形成时的黏弹性变化，故其结果受血小板功能、凝血因子、天然抗凝因子和纤溶影响。对ASA和氯吡格雷监测灵敏度可以接受。
(3)锥板分析仪：提供高剪切应力的层流，适于验检测vWD和GPⅡb/Ⅲa拮抗剂，在小规模研究中，能检测对氯吡格雷的弱反应者。
(4)Verify Now分析仪(accumetrics verify now assay,)测定：枸橼酸全血中加入诱导剂TRAP使血小板与纤维蛋白原珠凝集时的透光度增加，凝集程度与透光度增加呈正比，结果以mV/10s报告。Verify Now分析仪优点:获得结果快(1 min),可床旁监测，不需标本运送; 仅需少量血标本;血液不需要处理，操作简便; 检测结果经微处理器后以数字显示; 检测结果不受抗凝剂和致聚剂的影响。是目前上市的新的血小板功能测定仪。最初是用街GPⅡb/Ⅲa拮抗剂监测，目前也被推荐在其他药物监测中应用。
(5)血小板舒血管剂刺激磷酸蛋白(VASP)流式细胞仪测定：其原理为：VASP是 ADP引起的血小板聚集反应时信息传递途径中的重要环节，是氯呲格雷通过P2Y12受体的生化学的靶。VASP为cAMP和cGMP激酶的底物，磷酸化位点分别在Ser 157和Ser 239,该蛋白活化时抑制GPⅡb/Ⅲa、PLC活化和钙动员。氯呲格雷阻断与ADP在血小板膜上的P2Y12受体偶联的Gi释放αGi和βγ,从而使cAMP升高，抑制VASP的磷酰化发生，致使GPⅡb/Ⅲa上纤维蛋白原受体活化受抑。血小板反应指数VASP(Platelet reactivity index VASP,PRI VASP)的临界值是>53%,其阴性预示值为99%，阳性预示值为12%,其灵敏度为93%,特异性为50%。预示在无ST段升高的急性冠脉综合征(ACS) PCI后头一个月的CV发生可能性。因此，此项指标除作为监测氯吡格雷抗血小板作用外，也是无ST段升高的急性冠脉综合征临床结局(作PCI者)的良好预示标志物, PRI VASP值升高预示氯吡格雷低反应者伴有复发性心肌缺血事件发生的增加。
(6)MeSAMP试验：此法由Neubauer于2008年描述。MeSAMP为血小板P2Y1抑制剂，当MeSAMP存在时，血小板对ADP的反应由于P2Y1被MeSAMP阻断，所以ADP对血小板的作用只能通过P2Y12受体途径，由此而能较特异地反映出氯吡格雷对P2Y12受体的抑制状况。试验采用阻抗法进行。在161例的测定中原先检测到的氯吡格雷低反应者38例(23.6%)，而经此法鉴别后确氯吡格雷低反应者仅为8例(5%)，而发现其中3例为P2Y12受体不足所致。由此项因此试验提示，在鉴定药物的抵抗性方面尚有许多未知因素需我们认真、细致地去探索。
根据2006年Michelson在欧洲心脏病杂志的建议，对氯吡格雷抵抗性的监测可首先对P2Y12受体特异的VASP 磷酰化作用检测 (流式细胞仪)，其次为Verify Now P2Y12 assay和ADP诱导的比浊法血小板聚集。
3.3 GPⅡb/Ⅲa拮抗剂监测：GPⅡb/Ⅲa拮抗剂在临床应用中存在出血和血小板减少的副作用，有人怀疑它与上述两种药物一样，可能存在“抵抗性”。目前认为采用能作床旁检测的Verify Now 分析仪是首选的试验。它在反映GPⅡb/Ⅲa功能受抑制程度上更为特异，与血小板聚集仪中测得的GPⅡb/Ⅲa受体阻断率一致。也有人报道在GPⅡb/Ⅲa拮抗剂可采用全血单个血小板计数法和PFA?100TM仪测定。在比浊法血小板聚集仪中的ADP诱导的血小板聚集性测定虽然存在灵敏性不高，重复性差和技术要求高等不足，但在一般的临床实验室中仍不失为一项可以接受的监测手段。国产静脉注射型GPⅡb/Ⅲa拮抗剂(欣锥宁)现己在临床应用，实验室监测在这类药物中的意义将会累积更多的经验。
4 研制中的血小板检测装置
4.1 体外受刺激的血小板功能监测仪 为了模拟体内止血过程中所发生的血小板一系列反应(黏附、活化、聚集等)，除目前临床上已经应用的PFA?100外，巳设计的检测仪器有Clot Signature Analyser(CSA)、Thrombotic Status Analyser(TSA)、高剪切滤过仪和锥板分析仪。
4.2 血小板介导的凝血酶生成 血小板活化时的负电荷磷脂(PF3)提供生成凝血酶的Ⅹ酶和凝血酶原酶，血小板的存在使凝血酶生成量提高5至6个剂量级。此外，GPⅡb/Ⅲa也可能影响凝血酶原转变成凝血酶，因为存在凝血酶原结合位点。除既往的PF3分析外，新近设计的Hemostatus Device(USA)则是在aPTT试验中加入不同浓度的血小板活化因子，观察凝固时间的缩短。此项试验能鉴定血小板数低70×109/L时的出血倾向，血小板无力症，并在GPⅡb/Ⅲa拮抗剂治疗的监测中有用。
4.3 测定凝血块物理特性的仪器 血栓形成动力学中的平衡、收缩和溶解反映了止血栓子进行止血的能力，测定止血时凝块的各种物理特性，人们可获得许多获得性和遗传性血小板的功能缺陷。目前巳商品化的仪器有：血栓弹力图(thromboelastography,TEG)和测量血小板收缩力(platelet contractile force，PCF)的仪器Hemodyne Instrument。TEG在预示出血倾向中的精确率(87%)高于活化的凝血时间(30%)和凝血图(51%)。应用于出血性疾病和外科术前检测。Hemodyne能反映血小板总体收缩力。占血小板蛋白34%的肌动蛋白在血小板活化时通过重新组装而构成收缩力，这种收缩力通过粘着在纤维蛋白网上的伪足，使整个血凝块收缩。所以，Hemodyne测定了纤维蛋白网上活化血小板的收缩力，反映了凝块的弹性模量和凝块僵硬性，提供了纤维蛋白/细胞网物理结构的一个量度。可用于止血实验室对出血性疾病、心脏病、外科和特护的检测。
血小板功能检测
最早的检测血小板功能的方法是出血时间。Thiagarajan和Wu定义的皮肤表面出血时间为：在上臂处用血压绷带加压到40mmHg，然后采用一次性的自动的设备在前臂的掌侧皮肤表面上划一道长10mm，深1mm标准的切口，每隔30秒吸去伤口处的血液，直到出血停止。正常的出血时间少于10分钟。当血小板计数小于100×109/l时，出血时间会延长，因此这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺陷时作用有限”。它的优点在于操作简单，快速，不需要对血液进一步的检测和处理，缺点是受技术人员的操作技术，皮肤厚度和温度的影响。本方法缺乏一致性，在判断出血倾向方面是不敏感指标。
其它血小板功能检测方法需要小心抽血和处理。患者不能加绷带和一周不能服用影响血小板功能的药物。19-20号针头和塑料注射器用于静脉穿刺，从静脉穿刺到实验的间隔时间必需标准化，这是因为血样中丢失的CO2会使pH值升高，增加血小板对致聚剂的反应能力。必须防止溶血，因为溶解的红细胞会释放出血小板的诱导剂ADP。容器必须是塑料的或硅化玻璃以防止血小板吸附到容器表面。抗凝剂的选择以及温度也会影响血小板的功能，抗凝血应置于室温或37℃，而不能置于4℃。一般不推荐使用真空管，除非使用自动血小板功能分析仪（见2.4和2.5）。
最常见的抗凝剂是枸橼酸钠，它可以将钙离子的浓度降到微摩尔级（枸橼酸钠终浓度为10.9mM，钙离子的浓度为40μM；枸橼酸钠终浓度为12.9mM，钙离子的浓度＜5μM）。如果使用EDTA抗凝剂，钙离子的浓度将能低至不能使血小板凝集。肝素的效果不好，因为血小板经常粘附到试管壁，并且会使血小板集聚，在离心中沉积到红细胞中，使富含血小板血浆中的血小板数目减少。水蛭素和PPACK通过抑制凝血酶的活性来抗凝，它们可以维持生理性浓度的钙离子，而某些实验中正需要这种浓度，但水蛭素的价格非常昂贵无法常规使用。
2.1 血小板聚集
到目前为止评价血小板功能最常见的方法是测定血小板的聚集功能，抗凝血在离心力135g离心15分钟，制备富含血小板血浆（PRP）。如果可能，血小板计数应当标准化（如在浓度为250×109/ l时测定）,这可以通过加入少血小板血浆来实现。1毫升（或0.5毫升）PRP在37℃加入到装有金属磁棒的玻璃试管中，在聚集仪中磁棒以1100rpm转动，通过比色计记录穿过PRP的光强度。大多数诱导剂加入后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，引起短暂的光透过率的下降，然后由于血小板聚集，光透过率大幅度增加。光透过率增加的速度和程度会被记录下来。致聚剂主要为ADP，肾上腺素，胶原蛋白，花生四烯酸，TTXA2的类似物如U46619，或凝血酶受体活化肽如SFLLRN。（凝血酶不能作为PRP的促凝剂，因为会引起凝结）。正常情况下枸橼酸抗凝的PRP，对高浓度致聚剂反应的聚集程度，与TXA2的形成，颗粒内容物的分泌和血小板表面P-选择素的形成有关。
低血小板计数会影响血小板聚集试验，如果PRP中血小板计数低于100×109/l结果就不可靠。如果是脂血，也不能进行此试验。
如果血小板改变了形态，但不能与所有的致聚剂发生聚集，则其原因可能是罕见的Glanzmann血小板减少症。
与胶原蛋白或凝血酶相比，ADP是弱的致聚剂，在枸橼酸抗凝的PRP中，低浓度ADP只引起初步的，不完全的，可逆的聚集。但当浓度高于1-3μM时，初级的血小板聚集将不可逆，而且紧接着会引起第二相不可逆的过程（图1）。这个两相血小板聚集过程依赖TXA2的形成。高浓度ADP情况下，这两相聚集过程会融合，形成一个平滑的曲线（图1），类似于胶原蛋白或凝血酶的刺激效果。药物，如阿司匹林，会抑制TXA2的形成，阻碍了ADP介导的第二相聚集过程。在生理性的钙离子介质中，只会发生第一相的聚集反应。
ADP诱导聚集严重减弱，以及胶原蛋白和凝血酶诱导聚集受损，提示为罕见的P2Y12ADP受体异常。噻氯匹定和clopidogrel通过此受体作用，产生类似的对ADP诱导选择性抑制。
弱的致聚剂，肾上腺素（5-10uM），可聚集PRP中的血小板，而不改变血小板的形态，但肾上腺素的致聚作用并不一致。如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成的药物，血小板对任何浓度的肾上腺素都不反应，不会产生聚集。
胶原纤维（1-5μg/ml）会引起特征性滞后（可达1分钟）的血小板聚集,聚集需要TXA2形成和颗粒内容物的分泌，而且基本上是不可逆的。虽然血小板形态发生了变化，但是阿司匹林及其它抑制TXA2形成的药物可以阻断低浓度的胶原蛋白引起的聚集反应。罕见的GPVI缺陷症表现为血小板受胶原蛋白刺激后并不发生聚集，但在受到其它致聚剂的刺激后通常会发生聚集。
花生四烯酸可以转变为TXA2，因此可作为聚集剂。阿司匹林和其它可以抑制环氧化酶的药物具有抑制作用。但是TXA2的类似物U46619，却可以在此类抑制剂的存在状况下产生聚集作用。在罕见的环氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不诱导血小板聚集，但U46619会引起血小板的聚集。
SFLLRN(TRAP)具有凝血酶的诱导血小板强聚集作用的功能，只有当TXA2形成障碍时，这一作用才会稍有减弱。
分泌缺陷，特别是致密颗粒缺少ADP的增强作用，会造成异常的聚集，即存在正常的第一相过程，而无第二相过程。分泌缺陷时低浓度的胶原蛋白和SFLLRN诱导血小板聚集会减弱。
【血小板计数（blood platelet count,BPC）】
‘标本采集’
采手指血20ul，注入盛有血小板稀释液0.38ml试管内，立即混匀。
‘正常值范围’
100—300*10^9/L或10—30万/mm3。换算成SI单位因数：0.001。
‘临床意义’
1、增加：生理性有运动或进餐后，病理性有急性失血，溶血性贫血，出血性血小板增多症，特发性血小板增多症，真性红细胞增多症，慢性粒细胞性白血病早期，骨髓纤维化，淋巴网状细胞瘤，类风湿性关节炎，急性肾炎或肾病综合症，恶性肿瘤，结缔组织疾病，淀粉样变性，溃疡性结肠炎，急性化脓性感染，脾切除后，肾移植发生排斥反应时。
2、减少：生理性有妇女月经期；病理性有再生障碍性贫血，急性白血病，淋巴肉瘤，骨髓纤维化，何杰氏病，结核病，骨髓癌移植，坏血病，恶性贫血，肝炎，部分巨幼红细胞贫血，严重感染，苯、砷、金制成中毒，放射线及过度镭照射，抗癌药，抗甲状腺药，噻嗪类利尿剂，特发性血小板减少性紫癜，脾功能亢进，进行体外循环时，血栓性血小板减少性紫癜，弥散性血管内凝血，巨大血管瘤等。
1．生理性：正常人血小板计数一天内可有6-10%变化；表现为早晨较低，先后略高；春季较低，冬季略高；平原居民较低，高原较高；静脉血比毛细血管血高10%；月经前降你，月经后升高；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；运动后升高，休息后恢复。
2．病理性
（1）在临床上，除创伤之外，血小板减少引起出血常见原因。血小板数大于100×109/L，无异常出血；当小于50×109/L时，可有出血症状。常见的疾病有：①血小板生成障碍，如急性白血病、再生障碍性贫血；②血小板破坏过多，如ITP、脾功能亢进，系统性红斑狼疮；③血小板消耗增多，如DIC、血栓性血小板减少紫癜。
（2）血小板增多（血小板数大于400×10/L）；①骨髓增生性疾病：慢性粒细胞白血病，真性红细胞增多症；②原发性血小板增多症；③急性大出血，急性溶库存，急性化脓性感染；④脾切手术后。
【血小板凝集功能试验（PAgT）】
platelet aggregation
‘标本采集’
采静脉血9毫升，注入含4％枸椽酸纳1毫升的试管内抗凝。
‘正常值范围’
ADP法过筛试验，10—60S内出现凝集。
‘临床意义’
1、增加：见于手术后，糖尿病，急性心肌梗塞，静脉栓塞，肾移植后的排斥反应，高脂蛋白血症，抗原抗体复合物反应，静脉注射葡萄糖后等。
2、减退或消失：见于血小板无力症，血小板药，血管性假血友病，肝硬化，原发性血小板增多症，巨球蛋白血症，骨髓细胞增生综合症，以及应用低分子右旋糖酐，消炎病，保泰松等。
【血小板粘附（或滞留）功能（PADT）】
‘标本采集’
在涂硅离心管中加3.8％枸椽酸纳0.5ml，再用涂硅注射器采静脉血4.5ml，注入此离心管中轻轻混匀，在进行测定前7—10天内，不能服用阿司匹林。
‘正常值范围’
1、转动法：58—75％
2、玻珠法：20—60％
‘临床意义’
1、增加：心肌梗塞发作，静脉栓塞或大动脉阻塞，高脂蛋白血症，动脉粥样硬化，高血压，糖尿病，某些癌肿手术后，口服避孕药后。
2、降低：血管性假血友病，血小板无力症，巨大血小板综合症，急性白血病，巨球蛋白血症，多发性骨髓瘤，血小板增多症，尿毒症，肝硬化，先天怀纤维蛋白原缺乏症，以及口服阿匹林后。
【血小板功能闭锁时间试验（Col/Epi、Col/ADP）】
【血小板功能分析试验 Platelet Function Analysis test】
血小板功能检测因科技及样本不易处理之故，而长期被忽略其在临床上的重要性。近年来有科学家利用Shear-Flow rate原理，于体外模拟血管受伤后血小板黏附和凝集过程，其只需一管含抗凝剂的血液就可以使血小板功能检测在体外利用仪器真实的操作并取得分析结果。如此可以使医师对病患的血小板功能多一份了解(Primary Hemosatsis Capacity)，以帮助其在临床上的治疗。
血小板功能分析试验的适用的范围
1.替换出血时间(Bleeding Time)：根据 Dr. Paul Harrison, Dr.Carcao等人自1998年起的研究与观察，确认除极为罕见的血管异常外，PFA在疾病的敏感性上明显优于出血时间(BT)，与血小板凝集试验相关性达86%以上。Col/EPI其对初级凝血障碍的阴性预测值（Negative predictive Value NPV）为93.4%，阳性预测值（Positive predictive Value PPV）为81.8%。Col/ADP其对初级凝血障碍的阴性预测值（Negative predictive Value NPV）为79.4%，阳性预测值（Positive predictive Value PPV）为77.3%。
2.血小板抑制剂<Aspirin>的用药监控：阿斯匹灵<Aspirin>是心脏内科与神经内科的常用药品，其主要功能在抑制Thrombaxne generation，使血小板的凝集功能降低使保护血管再次栓塞。长久以来临床的经验发现约有25~45%的病患对阿斯匹灵有所谓的Non-responding的现象，但一直无理想的检验工具来协助。同时经过国内及本科的研究发现在国人也有相同的情况，并以PFA作为评估工具与Mark J. Alberts, Kjell Andersen等人研究发现相同，既Col/EPI对ASA-induced platelet dysfunction非常敏感，所以在临床上PFA被建议可以用于阿斯匹灵的用药评估。
3.在血液科或小儿血液科方面，对类血友病（von Willebrand disease; vWD）、血小板无力症（Glanzmann’s thrombasthenia）及Storage Pool Disease的筛检一直缺乏有效且适合的工具，据欧洲多位临床医师及学者于1998~2003年对上述疾病的研究发现PFA与BT的敏感性分析是(97% vs 66%)、(96% vs 59%)、(84% vs 55%)，所有结果显示出PFA优于BT。另一方面接受dessmopressin(DDAVP)治疗的vWD病人其治疗效果有从PFA的检测中显现出来。
4.术前的出血评估：平常大多只做到aPTT或PT而已（secondary haemostasis），对primary hemostasis capacity的检查大多忽略或只做出血时间(Bleeding Time)，此时容易出现非必要的输血或致死情形。所以Juergen Koscielny et al在其研究中发现利用PFA、病人病史及其他检查并配合部份治疗，可有效地降低非必要的输血或出血致死情形。
血小板在生理性止血、维持血管壁完整性以及某些病理过程,如血栓形成、动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用〔1,2〕。因此，血小板功能检测对早期发现是否有血栓形成的危险以及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。本文就血小板功能检测方法的研究进展作如下综述。
血小板功能检测可分为血小板一般功能测定，血小板黏附、聚集及释放功能的测定和流式细胞术（FCM）分析等。
血小板一般功能测定
这种测定包括出血时间的测定〔3〕、血块收缩试验、活化凝血时间测定、快速血小板功能分析法（RPFA）〔4〕等，是目前临床评价血小板功能的辅助手段。
血小板粘附功能测定
1941年Wright〔5〕建立了转动玻瓶法测定抗凝全血中的血小板在玻璃瓶表面的黏附特性。1960年，Hellem〔6〕建立了玻璃珠柱法测定枸橼酸抗凝全血或富血小板血浆的血小板粘附性。血液通过玻璃珠柱后，由于血小板粘附在玻珠或塑料管，以及形成的血小板聚集体被滞留在玻璃珠柱内。因此，过柱后血液中的血小板数降低，故又称滞留试验。1963年Salzman〔7〕对Hellem法加以改进，血液抽出后为经抗凝直接通过玻璃珠柱进行测定，本法有助于粘附性减低的出血患者的诊断，但对粘附性增高的血栓性疾病敏感性降低。
血小板聚集功能的测定
血小板聚集是血小板的一个重要生理特性，是其参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。血小板聚集功能的测定对于临床上诊断血栓前状态和血栓性疾病具有重要意义。长期以来血小板聚集活性的检测一直是血小板体外功能评价的金标准〔8〕。目前已有多种方法对血小板聚集活性进行定量或定性的测定。
肉眼或镜下检查法
主要观察聚集颗粒出现的时间及其大小，以判断血小板的聚集活性，但是只能粗略地评价血小板的聚集活性。
将全血以恒定的速度通过微孔金属网，若血小板聚集成团，则阻止血流通过，测定过滤前后的压力差来表示血小板聚集活性。
PRP比浊法
最初由Bron〔9〕提出，在特定的搅拌条件下，在富含血小板血浆（PRP）中加入诱导剂，血小板激活后GP Ⅱb?Ⅲa复合物暴露出纤维蛋白原的受体并与其结合而导致血小板聚集，血浆浊度降低，透光率增加，光电池迅速将光浊度的信号转换为电讯号，在记录仪上记录下电讯号的变化。
PRP比浊法是目前应用最广泛的一种测定法，临床上对于血小板无力症、原发性血小板增多症及血栓前状态和血栓性疾病的诊断具有重要意义。这种方法也存在不足之处：需要去除红细胞，可导致CO2的挥发和pH增高，不能完全反映体内血细胞之间的相互作用；测定时间过长可导致血小板活性降低；对血小板聚集物的形成不敏感，只能检测大的血小板聚集物；离心过程也会导致血小板的激活和红细胞碎片中血小板的丢失；血小板数目的调整难以标准化；重现性差〔10〕；而且高脂血症的PRP会影响吸光度，减少PRP与PPP之间的差异。因此，体外血小板聚集实验不能准确反应体内血小板的聚集功能和血小板活化水平的变化〔11〕。
全血电阻抗法
1980年Cardina和Flower〔12〕以电阻抗原理设计了一种测定全血中血小板聚集的方法，即在测定管中加入2个电极，加入诱导剂胶原或ADP，血小板发生聚集而堆积在电极上，阻抗就相应增加，在记录仪上记录这种阻抗，以观察体外血小板的聚集活性。这种方法的优点是直接使用全血，无需富血小板血浆的制备，操作更简便快捷；无需经过离心，是新型血小板功能试验和血小板拮抗剂评价的良好供选方案〔13〕；对于脂血标本的测定，可以克服比浊法因浑浊而影响结果。这种方法的不足之处，与比浊法相比较对小聚集物的形成不敏感，且每次测定后需要清洗电极，连接电极的电线需要小心放置，不能弯曲，使其很难满足临床工作的需要。
全血血小板计数法
用来测定血小板聚集时减少血小板数目。将枸橼酸钠抗凝的全血放到含有旋转离心磁棒的聚苯乙烯试管中，并在37℃下孵育，用甲醛固定单个血小板，以测定起始血小板数。加入诱聚剂诱导血小板聚集，并测定聚集后血小板数量，聚集前后进行比较，得出血小板减少的百分率。该法对很小的血小板聚集物敏感，并不需要对抗凝全血的稀释，耗血量少，所需时间短，可用于评价血小板功能异常的病人。
血小板功能分析仪（PFA?100）
PFA?100系统最早在1995年由Kundu等〔14〕提出，对抗凝全血的血小板功能进行定量检测。PFA?100模仿体内血管损伤时的止血环境，此系统由微处理器控制，使用一次性反应杯，内有一层生物膜，表面附有胶原，并含有ADP或肾上腺素。当用枸橼酸钠抗凝的全血从膜的小孔中抽吸出来时，血小板粘附于胶原并被ADP或肾上腺素进一步活化，形成血小板栓子，将小孔阻塞，仪器自动记录小孔完全阻塞的时间，所需的时间称为"封闭时间"。胶原和ADP用来区分先天和后天性血小板功能障碍，胶原和肾上腺素都适合检测阿斯匹林诱导的正常人血小板异常〔15〕。PFA?100操作简单，结果准确，临床上用于VWD和血小板异常的筛选，以及抗血小板药物治疗的监测和外科手术过程中初级止血的评价。然而PFA?100对于纤维蛋白原缺陷疾病的诊断的灵敏度低〔16〕。
体外血小板聚集计测定法
在高剪切力条件下测定血小板的黏附和聚集。该方法简单快捷，仅需要0.2ml血液〔17〕。临床用来抗血小板药物的治疗、血栓前状态及血小板功能亢进等疾病〔18〕和心胸外科出血的监测〔19〕。
剪切诱导血小板聚集测定法
该方法采用旋转式铁板流体测定仪，将PRP注入平板的内筒内，氦氖激光透过其中，通过圆锥的旋转产生剪切力，从而引起血小板聚集，血小板聚集引起PRP透光度的变化，由电脑进行分析处理，最后绘制成聚集曲线〔20〕。剪切诱导的血小板聚集对于血栓性血小板疾病，如脑血栓、动脉粥样硬化的防治具有重要意义。但是温度和血小板数目对该法的测定结果都有较大的影响。
散射性粒子检测法
该方法最先由Ozaki〔21〕提出，仪器采用He?Ne半导激光器（波长为675 nm）通过聚光镜折射成直径约为40 μm的激光束，照射到装有富血小板血浆（PRP）比色杯。该方法能通过血小板聚集颗粒的大小及其生成数量两个指标来评价血小板的聚集功能，血小板聚集颗粒的大小及数量与散射强度相一致，与比浊法相比，灵敏度有了很大提高。
微量板滴定法
即应用全自动定量绘图酶标仪根据比色法测定血小板聚集率。与比浊法相比较，微量板滴定法更灵敏、有效且重现性好，可用于检测已知血小板功能拮抗剂，如吲哚美辛、阿斯匹林等，且可以检测未知血小板调节因子〔8〕。该方法的最大优点是可以一次测定多个样品，尤适用于临床和科研中对批量血小板聚集率的测定。但是要求血小板计数在一定范围内的结果才比较准确。
血小板释放功能的测定
血小板胞浆内含有α颗粒、致密颗粒及溶酶体颗粒，当加入诱聚剂后会引起这些颗粒内容物的释放，即血小板的释放。α颗粒的释放主要通过β?血小板球蛋白（β?TG）和血小板4因子（PF4）来测定。用商品化的放射性免疫法和ELISA法试剂盒对其进行定量测定已被推广使用，其结果对样品的处理过程高度敏感，但是结果易受机体代谢功能和血小板破坏的影响。研究发现P?选择素即血小板α颗粒膜蛋白?140（GMP?140），表达在静息血小板膜上。当血小板活化后，P?选择素在血小板膜表面表达，并同时释放α颗粒的内容物，P?选择素可作为血小板活化的分子标志物〔22〕。在血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、子痫等血栓性疾病及糖尿病病人的P?选择素增加〔23，24〕。因此，检测P?选择素阳性血小板数量是活化血小板最为客观、直接、特异的检测方法。致密颗粒的释放可以通过5－羟色胺（5?HT）或腺苷酸的测定加以判断。5?HT测定应用荧光光度法测定，与同样处理的标准物比较，求得血小板或血浆中5?HT含量，用于筛选血小板贮存池缺陷导致胶原诱导的血小板致密颗粒释放障碍、先天性或后天性TXA2合成障碍、ADP受体缺陷等疾病。应用荧光聚集仪可同时测定血小板聚集和ATP的释放反应。
血小板其他功能检测
血小板其他功能的检测包括血小板凝血活性检测、血小板钙流检测以及血小板膜糖蛋白的检测等。血小板第3因子利用试验用于检测血小板凝血活性，使用正常人和病人富含血小板血浆(PRP)和乏血小板血浆(PPP)相互交*配合,以白陶土作活化剂促使PF3形成来测定血浆凝固时间,通过比较各组时差,从而得出PF3是否有缺陷，临床上用于诊断先天性PF3缺乏症、血小板无力症、骨髓增生异常综合征等。
大部分血小板内游离的Ca2+贮存在致密管道系统内，血小板活化后，Ca2+从致密管道系统释放至胞质内，细胞质内Ca2+水平增加。利用荧光探针标记血小板内钙离子，在诱导剂作用下，血小板的钙离子通道打开，使用共聚焦显微镜观察血小板荧光的强弱变化并经计算机控制系统及图像分析系统观察血小板浓度和钙流的变化。测定胞内Ca2+的方法可用于临床诊断与Ca2+代谢有关的血小板疾病。
血小板膜含有多种糖蛋白，通过SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可以将血小板溶液中的糖蛋白按分子量大小进行分离。血小板膜GPIb和GPIIb?IIIa复合物的测定用于巨大血小板综合症和血小板无力症的诊断。
流式细胞术在血小板功能检测中应用
随着流式细胞术的成熟以及各种荧光标记的单克隆抗体的研制成功并可以直接标记荧光素分子，为血小板活化机制研究开辟了新的局面。
传统的流式细胞术
即使用洗涤的血小板或PRP检测血小板膜糖蛋白的表达。样本在离心、洗涤等操作过程中极易活化，导致血小板体外激活，影响临床诊断价值。
全血法流式细胞术
主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，用流式细胞仪测定荧光强度和特异性荧光抗体结合阳性的血小板百分率，来测定血循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的应答反应。与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术有许多优点：直接应用全血，反映了血小板生理状态下的功能，同时简化了标本的处理，最大限度的减少了人为活化血小板；避免了因离心导致的血小板体外激活，并防止血小板亚群的丢失；标本用量少，尤其适用于儿童和血小板减少症的患者；亦能检测出少到1%的活化的血小板亚群，能分析单个或亚群血小板膜活化标志物的测定。此外，血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化〔25〕，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。然而，Ca2+流变化极为迅速，使得FCM定量测定较为困难。但是全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，仪器操作复杂；同时为了避免血小板体外活化，血样需在45分钟内处理，不能长久放置；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。而且，血小板膜糖蛋白种类多，与血小板的功能状态都有关系，目前还没有一个单抗或几个单抗的组合可以全面客观评价血小板功能，该方法还需进行更深入的研究使之标准化。
【参考文献】
