当前，免疫治疗已经成为肿瘤临床治疗中不可或缺的环节，免疫治疗的药物和方案涉及到人体免疫系统识别和攻击肿瘤细胞的各个阶段。

在人体免疫系统中，特异性细胞免疫是主要的抗肿瘤因素，其中由T淋巴细胞介导的细胞免疫应答主要分为三个阶段：① T细胞特异性识别抗原阶段；② T细胞活化、增殖、分化阶段；③ 效应T细胞的产生及效应阶段。T细胞是如何识别抗原一直是免疫学的中心问题之一。初始T细胞的TCR（T细胞受体）与APC（抗原提呈细胞）提呈的pMHC（抗原肽-MHC复合物）特异性结合的过程即为抗原识别。这是T细胞活化的第一步。抗原识别过程遵循MHC限制性原则，也就是说TCR在识别APC所提呈的抗原肽的同时，也必须识别pMHC中自身的MHC分子。MHC（主要组织相容性复合物，人类的成为HLA，及人类白细胞抗原）的限制性作用和TCR的发现，以及TCR分子立体结构的阐明，确定了TCR-MHC-抗原肽复合物在抗原识别及整个细胞免疫中的核心地位。因此，在肿瘤免疫中，明晰分别和/或影响TCR、HLA、肿瘤抗原的因素，或这三者之间的相互作用均有助于我们对抗肿瘤机制的理解。

TCR

TCR是免疫组库的主要研究对象之一（免疫组库是指特定时间段内机体内T淋巴细胞和B淋巴细胞多样性的总和）。因为免疫组库反映了人体适应性免疫反应的历史状态和当前状态，使得免疫组库的组成分析在基础和转化研究、临床诊断以及药物开发中都至关重要。高通量测序技术的出现导致了相关研究的爆发，而这一趋势还在延续着。通过对过去的15年中（2002年~2017年），每年发表在PubMed中的新的免疫组库测序论文的数量趋势，可发现当前对于免疫组库的研究还处在上升期（图1）。

图1 2002年~2017年间，每年发表在PubMed中的新的免疫组库测序论文的数量趋势

【Front Immunol. 2018 May 8;9:976.】

在肿瘤领域，免疫组库的主要应用方向有：癌症免疫治疗（如预测癌症患者的免疫治疗的临床效果）、生物标志物的发现、疫苗开发和功效研究，以及诊断和监测血液系统恶性肿瘤等。研究发现：

（1）TCR的多样性可作为黑色素瘤患者预后的生物标志物，外周血中具有较高的TCR多样性的患者与较长的PFS相关，而TCR多样性低的患者预后较差，与进展迅速的患者相比，晚期复发和长期存活的患者的TCR多样性明显更高【Pigment Cell Melanoma Res 2020 Jan 23】；

（2）王洁教授团队的研究发现，治疗前TCR的多样性能预测IIIB-IV期非小细胞肺癌患者在二线及以上免疫检查点阻断的临床反应，TCR多样性与抗PD-1/PD-L1治疗更优反应呈正相关；免疫治疗假性进展患者的TCR谱系的演变与PR患者的相似；外周血PD-1+CD8+T细胞中TCR的多样性和克隆性可作为非小细胞肺癌患者ICB治疗反应和生存结局的无创性的预测指标【Cancer Immunol Res 2020;8:146–54】；

（3）处于同一临床阶段的肾细胞癌患者，对手术前后的血液样本进行分析，发现基线（手术前）时期的TCR多样性可能是预测其预后的潜在生物标志物，较高的基线TCR多样性的IV期患者具有更好预后【J Pathol. 2020 Feb 19.】。

但在不同的研究中，TCR的多样性与肿瘤治疗的预后关系还不明确。比如研究发现在肿瘤高浸润T细胞或者血液T细胞的TCR多样性的宫颈癌和肺癌患者预后较好，但在膀胱癌中研究结论却是与之相矛盾的。所以单一的TCR作为肿瘤治疗的标志物还不够全面，也需要更多进一步的研究以确认TCR多样性与预后之间的联系是否具有肿瘤特异性。

pMHC（抗原肽-MHC复合物）

目前大多数癌种免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂治疗，面临的一个很现实的问题就是——只有一小部分患者从中受益，在某些瘤种（如黑素瘤、默克尔细胞癌、霍奇金淋巴瘤、MSI-H型肿瘤）中，未经选择的患者对单药PD-1阻断疗法的反应率范围在~40％~70％之间，而在其他大多数已批准的瘤种中反应率仅为10％~25％【Cancer Cell. 2020 Apr 13;37(4):443-455.】。因此很有必要了解促进肿瘤免疫逃逸的基因组或分子决定性因素。既往的许多针对不同瘤种的研究向我们阐述了具有能够破坏肿瘤新抗原与MHC结合能力的突变。比如说HLA基因的下调可能导致抗原呈递减少，从而促进肿瘤免疫逃逸。另外，一项回顾性分析显示，HLA-I和HLA-II均为杂合型的黑色素瘤患者免疫治疗具有更好生存获益；HLA-I 类基因座为杂合（胚系）且在其肿瘤细胞中至少存在一个HLA-I类基因座中具有LOH（体系杂合性缺失）的患者，相比HLA-I类基因座为杂合且无体系LOH的患者，存活率降低【Science. 2018 Feb 2;359(6375):582-587.】。

在针肺癌的TRACERx研究也发现，40%（36/90）的早期非小细胞肺癌患者存在HLA-LOH，并且HLA-LOH在组织学亚型中的发生率存在差异，在肺鳞状细胞癌中为61％（19/31），而在肺腺癌中为29％（17/59 ）（图2），该研究数据也显示出HLA-LOH是肺癌进化过程中发生免疫逃逸的常见机制。可以想得到，如果有HLA-LOH发生，在T细胞介导的细胞免疫过程中，抗原提呈细胞呈递给T细胞的特定的肿瘤新抗原或抗原新肽的数目将会减少。该研究根据这一思路，也比较了没有HLA-LOH的患者和发生了HLA-LOH的患者其肿瘤样本中非同义突变和新抗原的数量，并观察到发生了HLA-LOH的患者其肿瘤样本中非同义突变和新抗原的数量均显著增加。这一结论表明HLA-LOH可能允许潜在的抗原性亚克隆突变的积累，引起肿瘤突变负荷（TMB）的增加。【Cell. 2017 Nov 30; 171(6): 1259–1271.e11.】

图2 （A）TRACERx研究中HLA非同义突变、HLA等位基因失衡（AI）或LOH（杂合性缺失）的NSCLC患者数；（B）在肺腺癌和肺鳞癌中HLA-AI和HLA-LOH的比例。

【Cell. 2017 Nov 30; 171(6): 1259–1271.e11.】

最近发表在Annals of Oncology期刊上的一篇很有意思的研究就是通过检测HLA-LOH，用HLA-LOH校正过的TMB去预测NSCLC的免疫检查点抑制剂疗效【Ann Oncol. 2020 Apr 19. pii: S0923-7534(20)39295- 4.】。该研究对198例在抗PD-1/PD-L1治疗前采集的晚期NSCLC肿瘤样本进行了WES，设计了一种新的考虑HLA-LOH的方法去评估TMB，并在两个独立的免疫治疗患者队列（89个非小细胞肺癌样本和110个黑色素瘤样本）中进行了验证。研究发现：

（1）在测试集的198位患者中有54位患者HLA-I类分子中至少存在1个基因有LOH，HLA-LOH发生率为27%；存在HLA-LOH的患者其中位TMB值为199个突变，而没有HLA-LOH的患者其中位TMB值为118个突变，这一结论与上一段落中提到的研究结论一致；

（2）研究者用HLA-LOH校正过的TMB新算法重新计算了存在HLA-LOH患者的TMB，有了一个惊人的发现，用传统的四分法被定义为TMB-H（TMB值排前25%的患者）的10例患者被重新分类到TMB-L（低TMB）组，而相比于TMB-H的患者，这10例被重新归类到TMB-L组的患者其ORR（客观缓解率）、DCR（疾病控制率）、PFS（无进展生存期）和OS（总生存期）均较低。

这一研究结论也在验证集列队中得到了验证（图3），通过HLA-LOH校正的TMB可以改善基于TMB的生存预测，也就是说新的TMB计算方法提高了免疫治疗的疗效预测能力，这也解释了为什么用传统方法定义的一部分TMB-H患者其免疫治疗效果不理想。

图3 通过HLA-LOH校正的TMB对ICIs反应的影响

A. 用传统算法定义的TMB-H组和TMB-L组的PFS。

B-C. 通过HLA-LOH校正的TMB可以改善生存曲线的分离度。

D–F. 对使用ICI治疗的89例NSCLC肿瘤样本的重新分析表明，通过HLA-LOH校正的TMB可以改善基于TMB的生存预测。

该文章中也列出了这种新的TMB计算的方法，我们一起来看看。

公式中：

• TMB：非同义突变的数量（SNV和/或Indels）；

• NeoAg：生信算法预测的肿瘤新生抗原负荷（TNB）；基于预测的抗原肽-HLA结合亲和力来预测新抗原，然后再通过计算预测TNB；

• NeoAgL：和缺失的HLA等位基因相结合的新生抗原；当没有检测到HLA-LOH时，该数值为0；

• NeoAgC：既能与缺失的HLA等位基因结合，又能与仍然存在的等位基因相结合的新生抗原；当没有检测到HLA-LOH时，该数值为0。

  
  

这种通过HLA-LOH校正的TMB新算法，不仅需要了解肿瘤患者全面的基因组突变信息，还需要了解患者的HLA基因的分型情况、杂合性缺失的情况，以及肿瘤抗原肽与HLA结合亲和力。因此，想要更全面的预测肿瘤免疫治疗的临床疗效，单独的生物标志物（如TCR、TMB）均不足以准确的预测免疫治疗的应答，需要更强有力的工具从多方面进行分析。

基于TCR-MHC-抗原肽复合物在抗原识别及整个细胞免疫中的核心地位，海普洛斯专门针对其开发了全面分析的综合型工具：WESPlus+TCR测序。

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HapOnco™ WESPlus结合TCR免疫组库测序，能够非常全面的分析肿瘤免疫治疗疗效相关指标，可满足的分析除基于WES计算的TMB外，还涵盖了PD-L1蛋白表达、MSI（微卫星不稳定）、DDR基因（如HRR基因、MMR基因等）、免疫疗效正相关基因和负相关基因、超进展基因，以及病毒序列；特别是针对TCR-MHC-抗原肽复合物，不仅能够提供TCR多样性和均匀度分析，还能分析HLA-I类和II类分子的基因分型、肿瘤抗原肽与HLA结合亲和力等等。

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