目前仅有几种常用的非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤标志物（tumormarker），如癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC－Ag）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）等，其敏感性分别为26%-42%、51%-74%、20%-32%和28%，即使把他们组合成一组标志物来使用，其敏感性和特异性也没有显著的提高。有没有更好的肿瘤标志物提高NSCLC的诊断价值呢？近年来研究发现肿瘤相关蛋白质（tumor-associated protein）的血清自身抗体（serum autoantibody）可能提高了诊断NSCLC的敏感性和特异性，下面就血清自身抗体在NSCLC中的应用研究进展作一综述。
1.肿瘤免疫组学（cancer immunomics）与血清自身抗体
肿瘤在发生和发展过程中释放许多肿瘤相关蛋白质进入血液循环，部分蛋白质可以作为肿瘤标志物。人体免疫系统除保护机体免受病原体的感染之外，还可以防范包括肿瘤在内的其他危险因素，甚至能够消灭临床未检测到的肿瘤或癌前病变（precancerous lesion）。在临床发现肿瘤之前的数月或数年时间里，自身抗体就已经存在。抗肿瘤自身抗体的发生机制包括肿瘤相关抗原（tumor-associatedantigen）引起的宿主免疫应答、肿瘤细胞破坏导致抗原性刺激或者新生物形成诱发机体免疫功能失调。推测至少有4种主要肿瘤相关抗原：基因编码肿瘤特异性表达的抗原、基因点突变（如P53）表达的抗原、分化蛋白和在某些肿瘤中基因编码过度表达的抗原，这些抗原大部分首次在黑色素瘤中得到确认[1]。多个研究显示，更常见的是肿瘤患者被检测到某些肿瘤相关抗原的自身抗体[2,3]，例如，多种不同类型的肿瘤患者都可查到P53抗体[4], Yamamoto 等[5]在1例NSCLC患者的血清和胸腔积液里都发现了L-Myc基因过度表达和L-Myc抗原的自身抗体，Brichory等[6]在肺癌患者检测到自身抗体糖化粘连素annexins I 和annexinsII，而Ward等[7]在结直肠癌患者发现了HER-2/neu癌蛋白的自身抗体。
从肿瘤免疫组学的角度看，血清肿瘤抗原和自身抗体都可以作为肿瘤标志物，但血清自身抗体诊断肿瘤有许多优点：1）血清抗体较血清抗原更加稳定。2)特异性抗体的浓度较相对应的抗原高，尤其是在早期肿瘤负荷很小的时候。3)更重要的是血清特异性自身抗肿瘤抗体可以在肿瘤早期产生。例如，HER-2/neu抗体在乳腺原位癌[8]，P53抗体在早期卵巢癌[9]和结肠癌[10]均可被检出。4）自身抗体诊断的敏感性与特异性较高。Zhong[11]及其研究小组利用抗原芯片技术鉴定出含5 个噬菌体展示蛋白的自身抗体组合, 在NSCLC的检测中敏感性90%、特异性95%。5）由于检测用自身抗体蛋白都是已知蛋白，目前临床检测的一系列质检质控方法均可直接应用，自身抗体诊断肿瘤更加可行。
2.血清自身抗体的检测方法
2.1血清蛋白质组分析(SERPA)
血清蛋白质组分析(serologicalproteome analysis，SERPA)，也被Seliger等[12,13]称为PROTEOMEX，基于经典的蛋白组学工作流程，利用2-DE凝胶电泳、2-D免疫印迹技术（Western blotting）和质谱仪（MS）技术有效地分离、鉴定自身抗原。SERPA 把免疫印迹技术与2-DE凝胶电泳相结合，形成所谓的“2-D blotting ”技术，该技术把肿瘤组织或肿瘤细胞系的蛋白质转移并固定在一种半固体的结构里，肿瘤患者或健康受试者的血清被逐个进行筛选，使在数千个体经2-DE凝胶电泳技术分离出的蛋白质接受相关抗原的免疫检测（immunodetection），比较肿瘤患者血清和健康受试者血清的探针印迹（probing of blot），就可以鉴别能与肿瘤患者血清起特异反应的蛋白质的特征。
2.2 SEREX
在1990年代，Pfreundschuh及其同事[2]研发了SEREX（the serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNAexpression cloning，重组cDNA表达克隆的肿瘤抗原血清学分析）方法。SEREX方法是利用新鲜肿瘤组织构建cDNA文库，以重组的方法表达cDNA文库，转至膜上的重组蛋白质与患者血清IgG抗体发生反应，则被认为是肿瘤相关抗原。该方法鉴定了好几种抗原，如抗原NY-ESO-1是免疫治疗的候选抗原，展示了限制性表达方式并诱导细胞介导的免疫应答和体液免疫应答[14]。Naora等[15]应用SEREX方法，从卵巢癌患者血清分离出肿瘤抗原HOBX7，该抗原可能对卵巢癌的生长发挥重要作用。Scanlan等[16]用同样的方法研究结肠癌，但结果显示大多数SEREX定义的抗原与肿瘤或自身免疫没有相关性。从基因表达方式来看，SEREX定义的很多抗原表达范围较广。这些抗原大多局限于细胞内，正常状态下不接触免疫系统，当从肿瘤细胞释放后才被赋予免疫原性[2,16]。SEREX方法的一个缺点是必须构建表达文库，另外，该方法没法检测到翻译后的修饰。因此，必须寻找更科学、更先进的方法筛选肿瘤抗原，再利用肿瘤抗原检测自身抗体，达到筛查和早期诊断肿瘤的目的。
2.3 麦胚无细胞蛋白表达系统
无细胞蛋白表达系统以外源mRNA或DNA为模板,在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质，显示出快速、方便、易于高通量等优点。麦胚无细胞蛋白表达系统是真核表达[17]
，表达出来的蛋白在翻译后修饰方面远较原核表达复杂，更加接近人体的情况。
Tsuboi等[18]利用麦胚无细胞蛋白表达系统生成了疟疾蛋白，从而发现了新型的候选疫苗。HPtaa （Human Potential Tumor AssociatedAntigen database， http://www.hptaa.org）应用生物信息学方法预测的肿瘤抗原基因数达到3518个，CID（Cancer Immunome DataBase）里已经登记有1545个抗原基因。基于该基因库的候选基因和目前循证医学证据，可利用麦胚无细胞蛋白表达系统合成肿瘤抗原，利用这些抗原进行
血清自身抗体标签诊断早期肿瘤，有可能提高检测的敏感性和特异性。有关这方面的研究工作正在探索之中。
2.4蛋白芯片
蛋白芯片（microarray）价格低，效率高，高度平行地分析高通量的蛋白质。蛋白质芯片格式可以分为两大类别：顺相阵列和反相阵列[19]。反相阵列格式是把个体样本 （如抗原）固定在每个阵列里，每个阵列孵育一个检测试验样本（如抗体或血清），也就是用已知抗原检测自身抗体，达到诊断目的。抗原芯片非常合适研究自身抗体的免疫应答[20]，Lueking等[21]和 Joos 等[22]首先描述了运用抗原芯片特异地检测待分析的自身抗体，这些抗原阵列使用不同浓度的同一阵列内自身抗原，以确定作为自身免疫性疾病血清标志物的各种自身抗体的滴度。天然蛋白芯片用肿瘤组织或细胞系来源的蛋白进行筛选；而重组蛋白芯片利用cDNA表达文库或噬菌体表达文库进行筛选, 利用该技术已成功筛选出前列腺癌、NSCLC和卵巢癌特异免疫性蛋白[23,24]。
抗原芯片上的抗原缺乏恰当的翻译后修饰和蛋白质折叠，而这些正是抗体识别所必须的。另外，阵列里的重组蛋白质可能没有抗原性。抗原芯片只能对各样本之间作出相对的比较，而不能定量地估算自身抗体的水平。
3.血清自身抗体对NSCLC的筛查与早期诊断
Chen等[25]使用经过肺癌噬菌体表达文库生物淘选（biopanning）的高密度肽芯片，在2,304元的芯片里检测250份肺癌患者和无肿瘤对照者的血清，研发一个肺腺癌的“自身抗体谱”，结果发现包括抗泛素1(ubiquilin1)抗体在内的自身抗体谱在训练组和确认组诊断肺腺癌时的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、90.0%、85.6%、92.5%、77.6%和85.3%、86.0%、85.6%、90.1%、79.6%，推测自身抗体标签有可能应用于肺癌的筛查和早期诊断。
由于肺癌缺乏一个可接受的用于筛查的生物标志物（如PSA对于前列腺癌），该研究方法可能具有临床效益，并可筛查高危人群（high-risk populations）。Zhong等[26运用患者血清T7-噬菌体NSCLCcDNA文库以确定能被肿瘤相关抗体（tumor-associated antibody）识别的噬菌体表达蛋白，按照每个蛋白与23例Ⅰ期NSCLC患者和23例风险匹配对照样本反应的统计排序，从4000个克隆确认了212个噬菌体表达蛋白，经46例样本训练，采用logistic回归模型筛出5个最佳预测价值的抗体标志物组合，敏感性和特异性分别为95.7%和100%，产生受试者工作特征（receiver operating characteristics）曲线下面积为0.99。留一交叉验证（leave-one-out validation）取得了91.3%的敏感性和91.3%的特异性。再用这套5个抗体标志物组合来测试102例样本，包括6例发病即确诊为NSCLC的患者血清、40例影像学发现NSCLC之前1～5年留取的血清和56例风险匹配非肿瘤对照者的血清，结果准确地预测了这三类样本的比例分别为6/6、32/40和49/56，诊断NSCLC的敏感性和特异性分别为87.5%和82.6%，其中比影像学发现提早1～5年预测NSCLC的敏感性为80%。该研究认为自身抗体谱与其他综合性筛查策略结合，可能是早期发现NSCLC的强有力工具。
Qiu等[27]利用人类肺腺癌细胞系A549裂解产物来源的蛋白粘素I （annexin I）、 PGP9.5和14-3-3论旨抗原（14-3-3 theta antigens）制备抗原芯片，以确定这些抗原是否与无症状期患者血清的自身抗体相关，并探索是否在诊断前的血清里能发现其他抗原。共收集了诊断为肺癌前1年内的血清85例和健康配对者血清85例，结果发现了针对蛋白粘素I、14-3-3论旨抗原和一种肺癌新抗原LAMR1相对应的血清自身抗体，这些抗体先于症状和诊断之前出现，研究认为利用针对已知抗原的血清自身抗体可筛查和诊断无症状的肺癌。Leidinger等[28]利用一组可表达候选抗原的82个噬菌体肽克隆，把39例肺鳞癌患者、29例非肿瘤的肺病患者和40例健康志愿者的血清进行筛选，结果发现诊断肺鳞癌和健康志愿者的准确性为93%，从健康志愿者中分辨出低分化鳞癌的准确性为92.9%，而从非肿瘤肺病中辨别出肺鳞癌的准确性为83%，与ROCK1、PRKCB1 和KIAA0376具有序列同源性的3个噬菌体肽克隆与超过15%的肿瘤血清发生反应，但与正常或非肿瘤肺病血清不反应。该研究显示血清反应谱结合统计学分类方法，很可能把肺鳞癌患者从正常人和非肿瘤肺病患者区分出来。
Chapman 等[29]用ELISA检测正常对照血清50例、NSCLC患者血清82例和SCLC患者血清22例，以针对p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5相应的自身抗体，结果发现76例肺癌患者和89％的淋巴结阴性肺癌患者至少有针对1/7抗原的血清自身抗体水平升高，特异性达92％，虽然能诊断更多的鳞癌患者，但各肺癌亚组的检出率无显著性差异，该研究认为检测针对一种或多种肿瘤相关抗原优化组合的自身抗体免疫应答是一种敏感和特异的血液化验，可能有助于肺癌的早期发现。
把自身抗体谱作为筛查工具，需要经过严格的验证。隐性肺癌或癌前病变个体用来实施筛查试验的临床血标本太少，因此最好通过分析来自其他已结束或进行中的CT筛查试验存档的标本或为研究自体荧光支气管镜检查术而收集的标本，来完成结果的进一步验证。完整地评价自身抗体谱诊断肺部良性疾病和自身免疫性疾病的特异性，并确定其对肺癌与其他肿瘤的特异性，也是非常重要的。同时亦应测试对小细胞肺癌的预测准确性。当然，也应探索应用自身抗体谱鉴别CT筛查时发现的良、恶性结节。自身抗体谱的最后确认必须经过前瞻性肺癌筛查试验，随后进行严密的基于人群分析，以确定最佳的肺癌筛查方法。
4.血清自身抗体对NSCLC的疗效评价和对复发与转移的监测
Zalcman等[30]等用ELISA方法检测167例肺癌患者血清的P53抗体，在30个月动态监测了其中32例（16例P53抗体阳性：7例NSCLC，9例SCLC；另16例阴性：5例NSCLC，11例SCLC）P53抗体的变化。12例抗体阳性的患者在化疗过程中取得了4例部分缓解（PR）和8例完全缓解（CR），他们的抗体滴度与基线相比下降了50%以上，这些抗体的特异性被两种ELISA方法和免疫沉淀法所证实，P53抗体下降50%以上与总体疗效或总生存期具有相关性，但均未达到统计学差异；而16例抗体阴性患者不管疗效如何，都没有检测到P53抗体的体液免疫应答。治疗过程中抗体特异而快速的下降推测细胞核积聚的P53蛋白稳定水平对于检测抗P53蛋白的体液免疫是必须的。由于P53抗体滴度特异变化与疗效具有良好的相关性，推测可利用P53抗体进行疗效的评价和监测在临床可检查之前肿瘤是否复发。
Lee等[31]用ELISA和Western blot分析了中国台湾277例肺癌患者的P53抗体情况，阳性率为6.14%(17/277)，NSCLC和SCLC分别为4.88%和6.36%，17例患者中有6例化疗后P53抗体滴度下降，但P53抗体滴度下降与化疗疗效或生存期没有相关性，该研究认为P53抗体滴不可能作为肺癌化疗疗效的监测指标或预后指标。Bergqvist等[32]用三文治ELISA法检测了67例NSCLC患者放疗前后血清的P53抗体，发现P53抗体阳性率为27%(18/67)，69%(46/67)的患者放疗前留取了血清，结果显示P53抗体是延长生存期的良好预后指标，具有显著的统计学意义，作者认为放疗前血清P53抗体可能预测放疗后NSCLC患者延长的生存期。
5.血清自身抗体对NSCLC的预后作用
Bergqvist等[33]在一个回顾性研究里评价血循环中P53抗体与晚期NSCLC预后的关系，结果发现P53抗体与生存期无相关性，该研究显示P53抗体不适合预测哪些患者具有更好的预后，但需要前瞻性研究加以确认。NSCLC患者手术前血清P53抗体也与生存期没有相关性[34]。Mitsudomi等[35]研究了术前留取血清并作了肺切除的188例连续的NSCLC患者，使用ELISA检测血清，结果发现38例检测到抗P53蛋白的自身抗体，P53自身抗体与病理类型、分期和P53过度表达有相关性，但与患者生存期无关，该研究不支持P53自身抗体作为NSCLC患者的诊断或预后标志物。
HIRASAWA等[36]观察了30例不可切除的NSCLC患者和60例健康志愿者，用ELISA方法发现了MUC1抗体，患者KL-6/MUC1抗体的水平明显低于健康个体，且高浓度KL-6/MUC1抗体的患者1年生存率明显好于KL-6/MUC1抗体水平低下者；KL-6/MUC1抗体状态与死亡率呈现最显著的相关性。这些初步结果显示抗体水平的减少程度可能与患者的预后相关。
6.存在的问题与展望
目前，NSCLC血清自身抗体检测技术具有初步的成熟性和稳健性，但各实验室应注重质控方法的一致性，使诊断结果更具可比性和可重复性。同时，应用新技术持审慎态度，如利用麦胚无细胞蛋白表达系统合成肿瘤抗原，再应用肿瘤抗原检测NSCLC患者血清自身抗体到达诊断目的，这种新思路面临巨大的挑战。SCLC是一种异质性非常大的恶性肿瘤，人们还无法采用单一自身抗体对其做出正确的诊断，但多少个自身抗体才是最佳组合的自身抗体谱，必须充分权衡诊断的敏感性和特异性，利用ROC曲线下面积进行积极的探索。
另外，初步筛选出来的自身抗体谱，应在多中心诊断试验和筛查试验中得到验证。自身抗体谱与哪些流行病学普查方法（如高危肺癌人群的确定）、哪些影像学技术（如低剂量螺旋CT扫描）、哪些内镜学技术（自体荧光支气管镜检查术）相组合，才是最佳早期诊断和筛查策略。自身抗体谱集中于早期诊断和筛查，但对疗效评价、检测复发与转移和预后作用的研究偏少，证据不足，应留取动态的血清标本，参照Sheps 等[37]提出的诊断试验质量评价标准，设计和开展严谨的NSCLC诊断试验，应用循证医学方法（如Meta分析等），取得高级别的证据，使自身抗体谱真正成为NSCLC的标志物。
参 考 文 献
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